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59屆血液年會(ASH)臨床進展:基於非病毒系統開發的多項CAR-T療法,有效性和持久性彰顯巨大潛力丨醫麥黑科技


2018年3月16日06時 今日科學 醫麥客
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今天是2017年11月27日

農曆十月初十

醫麥客:有效性和持久性凸顯競爭力

2017年11月27日/醫麥客 eMedClub/2017年12月9日,一年一度的美國血液學會(ASH)年會將在亞特蘭大隆重開幕。近日,ASH年會摘要已火熱出爐,其中專注於開發新型CAR-T療法,致力於將最佳的基因編輯技術轉化為挽救生命的治療藥物的Poseida Therapeutics公司也公布了多項重量級臨床進展。

自體CAR-T

P-BCMA-101 的I期臨床研究

在血液系統惡性腫瘤中,多發性骨髓瘤屬於第二常見的病種,復發頻繁,且伴有多種相關併發症。而B細胞成熟抗原(BCMA)作為一種極為重要的B細胞生物標誌物,之所以引起極大關注,就是因為它的RNA幾乎總是在多發性骨髓瘤細胞中發現,並且該蛋白也被發現存在於多發性骨髓瘤患者惡性漿細胞表面。這兩個因素均表明BCMA絕對是值得耕耘的靶點。

2017年,以BCMA為靶點的CAR-T細胞療法已經顯示出了治療多發性骨髓瘤(MM)的巨大前景。近日,美國生物技術巨頭Celgene與合作夥伴Bluebrid剛剛聯合宣布,美國FDA已授予其CAR-T療法bb2121治療復發難治性MM的突破性藥物資格。同時,歐洲藥品管理局(EMA)也已授予了bb2121治療R/R

MM優先藥物資格(PRIME)

然而,目前的CAR-T治療策略被過量的短效效應細胞所阻礙,面臨著耐久性差、易導致急性毒性以及轉導效率低等問題。

P-BCMA-101製造過程(圖片來源 poseida)

不同於其他公司的自體CAR-T細胞療法,由Poseida公司開發的新型的CAR-T細胞產品P-BCMA-101,是將一種非免疫蛋白、全人源的替代支架Centyrin分子融合到標準的第二代CAR分子(a 「CARTyrin」)中,並且是用非病毒的piggyBac (PB)

DNA轉座系統製造的。

P-BCMA-101結構(圖片來源 poseida)

piggyBac (PB)基因工程編碼三個基因:一個基於iCasp9的安全開關,用於在需要時快速消除產物。一個anti-BCMA CARTyrin和一個用於生產接近100%純CAR+產物的選擇基因。

與用常規方法產生的CAR-T細胞(病毒載體產生的CAR-T細胞傾向於由更多已分化的T細胞亞群組成)相反,P-BCMA-101主要是由經久耐用的記憶性幹細胞樣T細胞組成(60-80%TSCM

)。

P-BCMA-101在體外的活性(圖片來源 poseida)

P-BCMA-101在體內的活性(圖片來源

poseida)

此前,該公司報導了P-BCMA-101針對MM細胞系(MM.1S、WT或p53-/-(「p53KO」))的體外和體內結果(在9月份結束的波士頓CAR-TCR峰會上,Poseida公布了臨床前結果,表明用P-BCMA-101治療可使所有具有侵略性骨髓瘤的小鼠活下來)。在本次ASH年會上,Poseida公司將公布開報導P-BCMA-101針對多發性骨髓瘤患者的I期臨床初步結果。(NCT03288493)

NCT03288493(圖片來源 clinicaltrials.gov)

▪ 臨床前

方法:使用基於流式細胞術的細胞毒性、CFSE增殖和多重細胞因子誘導測定法,評估P-BCMA-101在MM.1S細胞系和原發性MM腫瘤細胞中的功能活性。同時也在體內測試了P-BCMA-101對抗WT MM.1S細胞、p53KO

MM.1S細胞和原發性MM患者的異種移植物施用到人胎兒骨骼中並植入NSG小鼠中的有效性。

結果:對MM.1S細胞和原發性MM腫瘤細胞的特異性殺傷,以及CD4 +和CD8 + P-BCMA-101細胞的顯著增殖,展示了P-BCMA-101在體外有效的抗腫瘤活性。此外,共培養上清液的多重細胞因子分析表明主要釋放的是IFN-γ和GM-CSF。

為了評估P-BCMA-101在體內的有效性,研究人員對NSG小鼠注射了螢光素酶+ WT或p53KO MM.1S細胞。21天後,小鼠接受單劑IV劑量P-BCMA-101。所有未處理的小鼠表現出迅速的腫瘤生長並伴隨著血清M蛋白水平和生物發光成像(BLI)的顯著增加,並迅速死於疾病進展。相反,接受P-BCMA-101治療的100%WT

MM.1S攻擊的小鼠,在3-7天內,BLI觀察到腫瘤的迅速消除,並且所有小鼠在處理後60天保持存活狀態,直到研究結束。40%小鼠中,通過BLI觀察到腫瘤復發,但是隨後被控制(不再施用P-BCMA-101)。

類似地,雖然p53KO MM.1S腫瘤比來源於親代WTMM.1S系的腫瘤生長更具侵襲性,但是其中5隻小鼠中的4隻通過P-BCMA-101處理後,腫瘤也被控制到了低水平。有趣的是,一隻小鼠的腫瘤保持維持穩定(中等水平),類似於在人類患者中觀察到的疾病穩定不進展。

最後,為了評估P-BCMA-101針對原發性MM腫瘤細胞的有效性,研究人員將來自MM患者骨髓或外周血(PCL)的CD138純化細胞注射到PDX模型中。具有可測量的血清M蛋白水平的小鼠用單劑量的P-BCMA-101處理。在100%處理的小鼠中,

7天內M蛋白水平迅速下降到檢測不到的水平,表明了快速消除存在於人骨碎片異種移植物中的原發性MM腫瘤細胞。此外,這些小鼠在治療後的存活時間超過60天,顯示P-BCMA-101的治療結果能夠達到持久緩解。

結論:在體內外,P-BCMA-101針對BCMA+骨髓瘤細胞顯示出特異性、有效的和持久的抗腫瘤活性。並且P-BCMA-101對於p53KO

MM.1S細胞也是有效的(出現在耐受所有標準治療的大部分患者中的高風險MM亞型)。這些結果支持P-BCMA-101用於治療包括p53分子途徑中出現異常在內的復發性/難治性MM患者的臨床研究(研究表明,多達一半的復發難治性骨髓瘤患者在p53分子途徑中出現異常。患有p53基因突變的患者預後極差,由此導致的癌症對任何可用的治療方式都沒有很好的臨床反應)。

通用CAR-T

P-BCMA-ALLO1的臨床前進展

慢病毒產生的CARTyrin細胞表現出抗腫瘤效力,但不具有增強的記憶樣表型(圖片來源 poseida)

以上,我們提到了以BCMA為靶點的自體CAR-T細胞療法在治療多發性骨髓瘤(MM)的巨大前景。然而,在個體化基礎上生產自體CAR-T細胞卻面臨著諸如製造時間、重現性、一致性和成本等重大挑戰。另外一點需要注意的是,由病毒載體產生的CAR-T細胞傾向於由分化的T細胞亞群組成,而這與較差的體內耐受性相關。

基於以上不足之處,Poseida公司將高保真NextGEN(NG)CRISPR基因編輯系統與非病毒piggyBac(PB)DNA轉座技術結合使用,主要在高度可取的記憶性幹細胞樣T細胞亞群中產生CAR-T細胞,開發了P-BCMA-ALLO1,這是一種現成的(off-the-shelf)同種異體CAR-T細胞產品,克服了以上所提及的這些限制,可以給予任何多發性骨髓瘤(MM)患者。

(左)在供體allo CAR-T細胞上表達的TCR可識別患者MHCI並對正常組織發生反應,導致GvHD

(右)患者T細胞可能識別供體allo CAR-T細胞MHC並排斥移植的的CAR-T細胞

同種異體反應性損害同種異體CAR-T細胞的安全性和長期持續性(圖片來源 Poseida)

其中NextGEN(NG)系統用於破壞P-BCMA-ALLO1中的TCR和MHCI表達,以減少可能的同種異體反應性。在靜息T細胞中,NG系統能夠進行高效率的基因編輯(>84% for TCRα、>64% for β2M 、>50% for

PD-1)。而且在任何off-target的位置都沒有檢測到不確定事件,從而證明了該系統的精確特異性。

NextGEN CRISPR在增殖和休眠T細胞中進行有效的基因編輯(圖片來源 Poseida)

P-BCMA-ALLO1不能介導移植物抗宿主病(GvHD)和移植物排斥反應等同種異體反應。使用臨床可擴展的純化方法,P-BCMA-ALLO1細胞富集至> 99.5%TCR /

MHCI雙重陰性,並且通過標準的混合淋巴細胞反應(細胞增殖或IFNγ產生)評估同種異體反應性:7-12天基於CFSE的細胞增殖測定和20小時IFNγ-ELISPOT測定。與未編輯的CAR-T細胞相比,P-BCMA-ALLO1對同種異體PBMC刺激沒有顯示出任何可檢測的反應,也沒有觸發任何高於細胞增殖或IFNγ背景值的同種異體T細胞增殖反應。

基因編輯不影響CAR-T細胞功能或表型(圖片來源 Poseida)

在臨床前評估中,P-BCMA-ALLO1顯示了最佳T細胞表型和有效的體內外效力。超過95%的P-BCMA-ALLO1細胞是CAR+,並且大於50%的產物是CD45RA + CD62L

+記憶性幹細胞樣T細胞(TSCM),這是一種非常理想的早期記憶T細胞亞群。此外,值得注意的是,CAR-T細胞不表達包括PD-1、TIM-3和LAG-3等在內的任何耗竭標記物,也沒有在缺乏靶抗原的情況下表現出強直信號作為IFNγ產生的任何證據。在用BCMA +

MM細胞系進行的短期24小時體外共培養測定中,P-BCMA-ALLO1分泌高水平的IFNγ並介導強烈(70-90%)殺死細胞靶標。另外,超過80%的細胞在72小時的基於CFSE的增殖測定中增殖。

P-BCMA-ALLO1在植入MM.1S細胞的NSG小鼠模型(一種侵襲性的人類MM衍生的腫瘤模型)中也顯示出強效力。儘管所有對照動物通過生物發光成像(BLI)顯示出快速的腫瘤生長並在五周內死於疾病,但是所有經過處理的小鼠在研究期間是存活狀態。經P-BCMA-ALLO1給藥後,7-10天內腫瘤負荷迅速降至BLI檢測的極限。最後,在部分小鼠中觀察到幾次腫瘤復發,但是隨後在沒有再次給藥的情況下得到了控制。

總之,這些數據表明,P-BCMA-ALLO1能夠顯著降低同種異體反應性,與此同時保留了強效力,可安全有效地用於治療任何MM患者。

替代療法

CAR-T作為幹細胞移植的預處理方案

目前,自體或異體造血幹細胞(HSCs)移植已被證實能夠用於治療多種惡性和非惡性血液疾病。然而,其製備方案通常會帶來嚴重甚至威脅生命的併發症,因為需要全身輻射和/或化療的侵襲性和遺傳毒性治療,從而限制了其更廣泛的應用。先前試驗性的研究已經證實,受體HSCs的消耗是允許成功植入供體HSCs的預處理方案的基本要求。此外,動物和臨床研究還表明,同種異體anti-HSC供體T細胞還有助於幹細胞植入,但是通常伴隨著GvHD(移植物抗宿主病)的風險。

這促使研究人員考慮具有較小毒副作用的可替代的預處理方法來消除HSCs,如anti-c-kit 和anti-CD45抗體導向治療。這樣,通過應用短期的基因工程CAR-T細胞進行幹細胞移植預處理也可以實現對HSC的更精確靶向。

基於此,Poseida的研究人員通過使用非病毒piggyBac(PB)轉座子系統進行基因修飾,開發了一種新型可控CAR-T方法,用於受體HSC的靶向。與病毒載體遞送系統相反,piggyBac(PB)相對大的攜帶能力允許至少三個單獨的基因在相同的三個順反子轉基因盒內被編碼。這包括靶向已知在HSC表面上表達的人c-kit(CD117)或prominin-1(CD133)的第二代CAR。另外,耐藥元件作為選擇基因,與非基因毒性藥物組合提供了CAR-T細胞在製造期間純化的有效方法。重要的是,還包括小分子藥物誘導型安全開關基因以促進受體HSC耗盡後和供體HSC移植之前的CAR-T細胞的快速體內清除。最後,由於製造過程,大多數CAR-T細胞表達趨化因子受體如CXCR4,其可以允許更多的選擇性運輸到骨髓(BM)以根除駐留的HSC。

為了從一組anti-HSC

CAR構建體中選擇一個候選產品,研究人員首先用mRNA電穿孔處理來自人外周血的CD3/CD28刺激的T細胞,編碼每個針對c-kit或CD133的CAR候選物。通過流式細胞術在轉染的T細胞中證實CAR表面表達。通過共表達mRNA轉染的小鼠或人細胞系(EML-C1、TF-1和K562)的CAR-T細胞,表達c-kit或CD133。小鼠和人BM原代細胞也一樣。根據CD107a的表達和IFNγ的分泌,通過脫粒,從它們特異性激活CAR-T細胞中鑑定出了最重要的CAR候選者。此外,那些CAR還能夠選擇性地消耗c-kit或CD133陽性細胞。

有趣的是,一些mRNA轉染的CAR-T細胞即使在其可溶性配體幹細胞因子的存在下也保留了靶向c-kit+

TF-1細胞的活性。接下來,在相同的三順反子轉基因中將CAR候選物與選擇和藥物誘導型安全開關基因共表達,然後使用piggyBac(PB)穩定地遞送至T細胞。由CD62L和CD45RA的陽性表達確定的製造過程產生主要是記憶性幹細胞樣T細胞(Tscm)表型的CAR-T細胞,並且也表達高水平的CXCR4趨化因子受體。與mRNA轉染的CAR-T細胞類似,這些穩定轉座的細胞能夠具有廣泛的效應能力,包括表達c-kit或CD133靶細胞的特異性消耗。

進一步的研究將評估預先建立的異種人造血嵌合體以及標準白消安或輻射預處理對照的免疫缺陷型NSG小鼠中,由piggyBac(PB)產生的anti-HSC CAR-T細胞。這種方法構成了一種新型的靶向生物學療法,設想通過微量的毒性移植方案來消耗BM(骨髓)中的內源性HSCs,並用移植的同種異體或基因校正的幹細胞來取代它們。

▪ 關於piggyBac DNA轉座系統

相比較於病毒載體的優勢(圖片來源 Poseida)

不同於一般的CAR-T細胞,Poseida公司的CAR-T細胞不含有scFv結構,而是由全人源的Centyrin結構域組成,基於其專有的piggyBac非病毒基因遞送系統進行工程改造。在不使用病毒、細胞因子或磁珠的情況下,完成流線型和可擴展的製造過程,並且能夠持續生產出高濃度的患者治療所需的CAR-T細胞。相比較於傳統的基於病毒的CAR-T修飾系統,通過piggyBac技術平台的工作效率要高出30倍。

此外,通過piggyBac技術編輯T細胞還可以獲得高比例(>

70%)的記憶性幹細胞樣T細胞(Tscm),即使患者自身的這種T細胞亞型非常少。(其他CAR-T細胞通常只含有0-20%的這種Tscm細胞),而Tscm細胞可能會使得CAR-T產品對患者的治療更加有效。由Poseida公司開發的這些新型CAR-T產品都具有在治療過程中產生超高比例的記憶性幹細胞樣T細胞這一共同特徵,所以會產生強有效的持久應答,無需二次治療。

▪ 關於NextGEN CRISPR基因編輯系統

TALEN、CRISPR/Cas9、NextGEN CRISPR(圖片來源 Poseida)

相比TALEN技術只能用於激活的細胞的使用限制性,CRISPR/Cas9由於可能的脫靶突變也存在著潛在的生產上的安全風險。而Poseida公司的新型的混合基因編輯系統 NextGEN CRISPR就可以在解決脫靶突變的同時克服靜息T細胞的編輯限制。

使用NextGEN CRISPR產生的同種異體CAR-T細胞既不反應也不被不匹配的同種異體T細胞排斥,這展示了一個真正的同種異體CAR-T產品的製造。此外,基因編輯的CAR-T細胞完全能夠殺死腫瘤細胞,並表現出高度有利的幹細胞記憶表型(TSCM),這被認為可能是治療患者癌症復發的持續控制的關鍵。

參考出處:

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