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Nature Neuroscience:在用光遺傳學嗎?這個問題要注意了!

7月
03
2019

2019年7月03日01時 腦科學新聞

腦科學新聞

現在在神經科學界廣泛使用的光遺傳學技術,是通過在神經元上表達光敏感的視蛋白,然後酷炫地用光控制神經元的活動。實際上,Owen組的新研究表明1,打光到大腦中實際上可能會加熱腦組織,在即使沒有視蛋白的情況下也能對神經元活動以及動物的行為產生影響。

這個發現將如何影響在「光時代」下的實驗設計呢?

光遺傳學技術成功實現了科幻小說中描寫的場景:把雷射打入大腦。目前它已經成為神經科學實驗室里的一個標準實驗方法。研究人員可以利用光敏感的離子通道,病毒載體技術和轉基因老鼠品系等等手段來任意切換神經元的開關,從而研究神經元對生物和行為上的影響。

但是當我們用光子對神經元「狂轟亂炸」,是不是會無意間對神經元會造成一些意料之外的影響?

Owen在Nature Neuroscience上發表的文章表明用光照背側紋狀體 (dorsal striatum)的中型多棘神經元(medium spiny neurons, MSNs)導致的對該腦區的加熱抑制了神經元的活動從而影響了動物的運動行為。在使用持續光照時這種影響更大,而使用持續光照正是抑制性光遺傳技術常用的手段。

laser into brain

在活體中使用光遺傳控制神經元活動包括一系列的操控:病毒轉染,蛋白表達,光纖埋置(會對目標腦區上方造成相應的損傷)。目前所有常用的對照組實驗設計都是一組表達了附有螢光團的視蛋白的動物對照另一組僅僅表達了螢光團的動物。然而,在這些實驗中,所有實驗組都接受光照。

研究人員想要了解僅僅光照本身是否會影響神經元活動。事實上,這極有可能,很多的生命過程都被證實是溫度敏感的。對腦組織產生熱能效應的擔憂在光遺傳技術開始之初就被出現了,刺激了預估光熱分布的模型的發展。可是,通過模型來預計影響神經元活動的光熱的證據十分有限。關於可以解釋這種效應的機制也沒有得到很好的研究。

Owen通過在野生型小鼠背側紋狀體植入的光纖下再植入一個記錄神經元活動的電極,通過比較中型多棘神經元在光刺激發放和不發放時的「點火率」,來研究光熱效應。

神奇的是,即便是沒有任何光遺傳的結構體的表達,持續的光照也會抑制神經元的活動。同樣的效應也可以在急性腦切片中被重複。在這兩種情況下,神經元活動的下降與雷射的強度顯著相關。

無視蛋白表達的神經元接受光刺激2

為了驗證這個假設,Owen測量了背側紋狀體植入的光纖下部的溫度,他們發現光照引起的溫度上升的時間進程和中型多棘神經元活動下降的時間進程一致。

在實驗中,研究者通過膜片鉗發現無須雷射照射,而是直接控制腦片局部的溫度,就可以激發中型多棘神經元的外向電流(outward current),並且中型多棘神經元活動的改變程度與溫度變化成正比。

有趣的是,另一個類似的實驗為發現這個神秘電流的離子通道提供了第一證據:將它的電流-電壓關係畫出後,發現其電生理特徵非常類似一個內向整流的鉀離子通道的電流-電壓曲線。該電流會被銫基底(cesium-based)的內部溶液消除,更加證明了光照發放激發了鉀離子電導。

另一些實驗表明,光激發的電流出現在多種表達鉀離子通道的神經元(紋狀體,齒狀回,皮層)類型中同時很少出現在無鉀離子通道表達的一種神經元類型中(海馬CA1區的錐形細胞)。

儘管未來還需要更多的工作來證實這些證據,Owen和他的同事們的研究結果支持了光激發引起的熱能可以對內向整流鉀離子通道進行調控從而抑制神經元活動。

儘管已經找到光熱引起的電流的潛在「分子元兇」,Owen繼續通過實驗證明目前廣泛應用的光遺傳實驗方案是否會影響動物行為。他們在一組野生型小鼠的背側紋狀體植入光纖,研究單側光照對小鼠曠場(open field)運動行為的影響。驚奇的是,光照刺激的發放本身就足以使小鼠背離繞圈運動,這種影響與抑制中型多棘神經元的活動產生的效果一致。

儘管這項研究有很多重大的發現,仍存在一些機理相關的問題沒有解答。例如,研究者們用來證實光照刺激引發的電流的來源是內向整流鉀離子通道的證據不是一種直接的自然狀態,未來仍需更多的實驗來提供信息。

一種可能的方法是檢驗在基因敲除小鼠(缺失鉀離子通道的某個或者某幾個亞基的表達)中這種光照引發的電流是否消失。如果確是以上信息,其他鉀離子通道可能引發光照電流的貢獻不能被完全排除。此外,膠質細胞也表達內向整流鉀離子通道,它們的生理特性也有可能被光照的釋放所影響。

未來還需要更多的工作來描繪網絡層面的對於突觸可塑性的影響以及由於膠質細胞功能改變引起的神經遞質從突觸間隙清除的影響。Owen的工作為光照引發的溫度改變調控鉀離子電導從而無須視蛋白表達就可以改變神經元活動並對行為和生理產生影響提供了強有力的證據。

更實際的結果是我們在未來如何優化光遺傳學的實驗設計呢?

組織被加熱去覺得很多光照激發的變量。通過利用計算機模型,Owen證實了熱效應可以通過更短的脈衝發放時長、更低的雷射能量、更長波長的光,以及頻率更高的刺激發放來實現最小化。在這些變量中,脈衝發放時長和雷射能量似乎是影響溫度的最重要的元素。

如果脈衝發放時長不到100 ms, 高達30 mW的雷射能量引起的溫度變化僅為0.1 ℃,幾乎可以忽略。

如果雷射能量低到0.5 mW,脈衝時長長達20 min,的雷射能量引起的溫度變化僅為0.2℃,也幾乎可以忽略。

因為大部分的光遺傳刺激模式的脈衝時長都小於100 ms並且鈣成像也通常使用毫瓦級別的光能,光照引發的熱能問題大多數集中於發放持續光照刺激的光抑制的實驗中。

下面,他們評估了一系列目前可以找到的光抑制的工具,來鑑別哪種視蛋白在減少光熱效應的角度下最合適於光抑制實驗。

抑制性視蛋白廣泛的應用於引發臨時性的特定「功能喪失」調控。氯泵(chloride pump)halorhodopsin(eNpHR3.0)3被廣泛應用於光抑制實驗並且被證實可以有效地被大約3 mW的黃光(波長509 nm)引發高達100 mV超極化。根據Owen的計算機模型數據,halorhodopsin可以使用長達1 s脈衝時長的抑制模式實現光熱效應最小化。

Jaws是另一種抑制性工具,它也有類似的特徵但是對紅光更敏感,因為紅光波長更長,因此有可能實現1s以上脈衝時長的光熱效應最小化。

儘管不是很常用,光激發的陰離子通道GtACR1和GtACR2在光敏感性上比氯泵更有優勢,0.1 mW以下的雷射能量也能引起較大的電流。這使得GtACRs和SwiChR++(一種僅由短脈衝光照就可引髮長時間的電流響應的雙穩定陰離子通道)成為避免長時程光抑制對腦組織加熱的有力工具。

光碟機動的氯泵halorhodopsin的結構

可是,GtACRs、SwiChR++或者其他的陰離子通道(例如,iC++)對神經元活動的影響取決於局部區域氯離子的梯度。因此當逆轉電位下氯離子的去極化,這些工具有可能矛盾地產生激發作用。

類似地,常用的質子泵ArchT展現了更優於halorhodopsin的光敏感性,但因為有報導稱質子泵eArch3.0在抑制時會受pH值影響產生自發神經遞質的釋放,它的應用也很複雜。綜合來看,halorhodopsin和Jaws還是在氯離子梯度未知的環路中光抑制的最有效的工具。

除了選擇視蛋白,Owen提供的數據也為未來的實驗設計提供了思路。例如,作者強烈支持加入另一組僅表達了螢光團並且不用雷射刺激的對照組。光抑制實驗包含光關閉的對照,特別是雷射關-開-關的行為範式能夠讓我們更清楚的區分視蛋白或者光熱效應對生理以及行為的影響。

如果無須精準時控,使用藥物遺傳學(僅由設計藥物激發的設計受體,DREADD)抑制工具hM4Di,通過給予藥物CNO來激發內向整流鉀離子通道從而實現抑制功能,或者通過基因靶向表達神經毒素(例如TeNT)來永久性的使神經元靜默。這些神經元抑制的其他選擇和和急性光抑制相比都是在自然狀態下的長期過程,會從不同方面引起網絡動態的變化。然而,無論這些實驗結果如何,這些補充方法都幫助證明了觀察到的影響並非是光熱效應引發的「假象」。

總的來說,該研究證明了光引發的組織被加熱可能是很重要的元素,我們在抑制型光遺傳學實驗設計中需要提供對照組。

同近期相關的報導(非特定類型細胞表達的Cre小鼠系的生殖系重組,抑制型視蛋白的矛盾激發效應,在DREADD實驗中用到的藥物CNO的脫靶效應等)一起,Owen的工作為研究者提供了一個很重要的提醒:對於精細控制神經元活動的技術發展非常複雜,我們對於這些技術的使用也需要跟著一同複雜化。因此對技術相關的不可避免的警告和局限我們都要闡明和解釋。

參考資料:

1.Owen, S. F., Liu, M. H. & Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nat Neurosci 22, 1061-1065, (2019).

2.Cardozo Pinto, D. F. & Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nat Neurosci 22, 1039-1041, (2019).

3.Kolbe, M., Besir, H., Essen, L. O. & Oesterhelt, D. Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 A resolution. Science 288, 1390-1396, (2000).

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