撰文 | 十一月
責編 | 兮
基因組被轉錄、複製以及修復的過程中都涉及到DNA的旋轉。但是如何去測量和記錄DNA在如上過程中旋轉的角度、時間以及路徑呢?目前探測DNA旋轉方面已有一些方法,比如轉珠記錄1-3、角度光學捕獲4以及磁鑷5等等以觀測如RNA聚合酶6、解旋酶2、DNA重組酶7等過程中出現的DNA旋轉現象。2001年發表在Nature上的一篇文章首次透過光學顯微鏡即時記錄了DNA在轉錄過程中的旋轉6。該文章將螢游標記的磁珠與DNA相連,在大腸桿菌RNA聚合酶轉錄時,透過記錄磁珠螢光即時旋轉的情況作為DNA旋轉的影像(圖1)。
圖1 首次即時記錄DNA旋轉的工作系統模式圖(上)與光學顯微鏡中旋轉著的螢游標記的小珠的快照圖6
類似於轉珠記錄等方法為探索DNA旋轉過程邁出了成功的第一步。但是,想要詳細地記錄DNA旋轉過程並且排除額外新增作用力的情況下進行測量並不容易,尤其是如何彌補現有測量方法中時間解析度不高的缺陷。
為了解決該問題,2019年7月18日,哈佛大學的莊小威研究組在單分子成像方面再次取得重要進展,於Nature上發文Rotation tracking of genome-processing enzymes using DNA origami
rotors,為在修復以及轉錄等過程中涉及DNA旋轉現象提供了新穎且有效的測量方式。
莊小威研究組建立了名為基於可摺疊DNA(DNA摺紙)轉子的成像追蹤技術(Origami-rotor-based imaging and tracking, ORBIT),使用螢游標記的DNA轉子在單分子水平上追蹤毫秒級別的DNA旋轉過程(圖2)。
圖2 ORBIT系統示意圖。以螢游標記DNA摺紙轉子,從而記錄和放大粘附在玻片上的馬達蛋白引起的DNA旋轉過程
什麼是DNA摺紙技術?在2006年Paul W. K.
Rothemund建立了一種將長的單鏈DNA摺疊成為任意二維形狀的方法,以長單鏈DNA作為支架,短的核苷酸鏈作為填充,混合之後可以形成所設定的特殊形狀(圖3)8。隨後又發展出能夠建立三維結構的DNA摺紙技術9。莊小威研究組的DNA旋轉記錄系統正是基於該DNA摺疊技術。
圖3 DNA摺紙技術構建不同的形狀的DNA圖案8
為了驗證ORBIT技術對於DNA旋轉過程的測量是否準確,作者們使用常見於DNA修復過程中的解旋酶RecBCD複合體10在DNA修復過程以及RNA聚合酶在轉錄過程中引起的DNA旋轉現象進行測量。作者們使用的DNA摺紙轉子包括四個葉片,每個葉片垂直於旋轉軸延伸80nm。雙鏈DNA片段沿著旋轉軸從轉子中心延伸用DNA相互作用酶的底物(圖2)。80nm的DNA長度既能夠在DNA旋轉過程中放大DNA的動作,又能夠最大程度的降低流體阻力和扭轉剛度,因而保證了該記錄系統高度的時空解析度。
作者們螢游標記了DNA摺紙轉子其中一個葉片的尖端,透過原子力顯微鏡記錄可以發現,DNA摺紙轉子的組裝是成功的且成功率很高,並可以將RecBCD複合體引起的DNA旋轉過程的路徑進行記錄(圖4)。
圖4 ORBIT實驗系統的組裝情況以及DNA旋轉路徑記錄
為了進一步證明ORBIT實驗系統運用的廣泛性,作者們嘗試希望透過ORBIT系統記錄轉錄過程中RNA聚合酶引起的DNA旋轉。結果顯示RNA聚合酶引起的DNA旋轉對應於DNA單鹼基對的逐漸易位,表明RNA聚合酶引起的DNA旋轉運動與單個鹼基的DNA螺旋之間的緊密耦合。
總的來說,莊小威研究組開發的ORBIT方法可以用於在極高的時空解析度和高通量的情況下追蹤單分子旋轉,並進一步證明了DNA奈米技術在研究生物大分子運動方面所展現的巨大潛力。由於DNA摺紙轉子的結構特性可以由研究者自由決定,因此,ORBIT在DNA旋轉測量和酶動力學等方面的研究將具有廣泛的前景。
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參考文獻
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