胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由腸道L細胞分泌的一種腸肽激素,具有多種生理功能,有顯著的血糖濃度依賴的刺激胰島素分泌作用,可以降低空腹和餐後血糖,在2型糖尿病的臨床治療中具有較好的應用前景。但由於GLP-1在體內半衰期很短,被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和腎髒代謝作用,使其臨床應用受到了很大限制。因此,開發更穩定的新型GLP-1類似物或緩釋制劑,延長其體內有效作用時間己成為近年來關注的熱門課題。
首先構建纖維素結合域(CBD)與鏈黴親和素(SA)的融合蛋白,制備了表面生物偶聯SA的纖維素磁性微球(SA-CBD-MCMS),通過生物素(biotin)結合的Oligo(dT),建立了從細胞或組織中快速提取mRNA的方法,並從大鼠胰腺中提取mRNA,克隆了大鼠GLP-1受體(GLP-1R)。並將含有GLP-1R基因的重組表達載體pcDNA3.1(+)/GLP-1R轉染含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的CHO/EGFP細胞,經抗性篩選、流式細胞分選和功能性分析,得到了穩定轉染的細胞系CHO/EGFP/GLP-1R。該功能性報告基因細胞分析系統可以劑量依賴性的通過EGFP表達,對GLP-1R激動劑的體外活性進行定性定量分析,為研究、開發和評價長效GLP-1類似物奠定了基礎。
研究合成了含有31個氨基酸的新的GLP-1類似物KGLP-1,其結構是在天然GLP-1(7-37)酰胺的N端添加一個賴氨酸(Lys)。利用上述CHO/RGFP/GLP-1R細胞評價體系及自制DPP-Ⅳ粗酶液對KGLP-1的體外活性和穩定性進行分析。結果顯示,KGLP-1能以劑量依賴的方式激活GLP-1R,其EC50值(2.44 nmol/L)與天然GLP-1(0.83 nmol/L)相比略有升高；但KGLP-1具有顯著的抗DPP-Ⅳ降解作用,與DPP-Ⅳ粗提物作用12 h後仍能保持80％的活性。進一步體內活性分析結果表明,KGLP-1能以劑量依賴的方式顯著降低小鼠體內的血糖水平,在同等劑量下,給藥2 h後仍具有明顯的降血糖和促胰島素分泌作用,而天然GLP-1在給藥1 h後活性即消失。在糖尿病模型小鼠實驗中,KGLP-1也同樣顯示出了明顯的降血糖作用(p<0.01)。
研究制備了KGLP-1與HSA的融合蛋白KGLP-1/HSA,並對其體內外活性、穩定性進行了分析。體外分析結果表明,KGLP-1/HSA具有與GLP-1相似的GLP-1R激動劑活性,EC50值為314 nmol/L,雖然其活性低於天然的GLP-1及類似物KGLP-1,但顯示了明顯的抗DPP-Ⅳ降解作用,12 h後仍能刺激CHO/EGFP/GLP-1R細胞產生較強的熒光,其強度為原來的84％。體內活性分析結果表明,雖然KGLP-1/HSA在給藥後1 h才表現出明顯的降血糖、促胰島素分泌的作用,但這種活性可以維持8 h以上,而GLP-1與KGLP-1在給藥1至2 h後效果即不顯著。以上結果表明,通過與HSA的融合,KGLP-1/HSA能明顯地減緩其體內代謝清除率,延長其體內作用時間。
研究對KGLP.1的注射緩釋制劑進行了探索。利用複乳(W/O/W)溶劑揮發法制備了載KGLP-1的PLA和PLGA微球,分別考察了高聚物的種類、平均分子量等因素對微球形態、平均粒徑、包封率和體外釋藥特性的影響。結果發現,該類微球的包封率都小於40％,藥物損失大。而采用S/O/O溶劑萃取法制備的載KGLP-1的PLGA長效注射微球其形態特征、包封率、體外釋藥均顯示了較好的結果。電鏡分析顯示微球表面相對光滑致密,大小均一,平均粒徑為33.5μm,包封率為85.5％,微球初始6 h的突釋為15.3％,14 d的累計釋放總量達到69.5％。采用糖尿病模型大鼠皮下注射給藥,對血糖和血清胰島素水平的考察結果顯示,載有KGLP-1的PLGA微球可以提供穩定的藥物釋放,實現了給藥一次,緩釋10 d,控制血糖、促進胰島素分泌的效果。
以自行開發的SA-CBD-MCMS為工具,提取大鼠胰腺mRNA,克隆了大鼠GLP-1R。然後以GLP-1R為靶點構建了含有EGFP報告基因的功能性細胞分析系統CHO/EGFP/GLP-1R,以此作為GLP-1R激動劑體外活性評價的細胞模型。利用該模型對新型GLP-1類似物KGLP-1及其與HSA的融合蛋白KGLP-1/HSA進行體外活性、穩定性評價,結合KM小鼠、糖尿病模型動物的體內實驗,證明了KGLP-1作為一種新的抗DPP-Ⅳ降解的GLP-1類似物的有效性,並通過與HSA的融合,可以延長其降低血糖、促進胰島素分泌的作用時間。同時,采用PLGA為包埋材料,S/O/O溶劑萃取法成功制備了載KGLP-1的緩釋微球制劑,實現了長效治療的效果,為開發能夠用於2型糖尿病臨床治療的長效GLP-1類藥物及其緩釋制劑奠定了理論基礎。
